Pomiar zawartości kwasu za pomocą miareczkowania pozwala zorientować się w całkowitej zawartości wszystkich kwasów w soku/cydrze. To jest bardzo istotny pomiar, bo kwasowość całkowita ma fundamentalne znaczenie dla cydru.
Ale jako że jest to pomiar sumaryczny, nie można na jego podstawie określić udziału poszczególnych kwasów. Wprawdzie w świeżym soku dominuje kwas jabłkowy, ale w gotowym cydrze już niekoniecznie: w wyniku przemiany jabłkowo-mlekowej kwas jabłkowy może być częściowo, lub w całości, zastąpiony przez kwas mlekowy.
Do tej pory, chcąc się zorientować czy w moim cydrze zaszła FJM, wysyłałem próbkę do laboratorium. Niedawno odkryłem, że takie badanie jest proste i można je przeprowadzić we własnym zakresie!
Zawartość poszczególnych kwasów w próbce soku lub cydru można określić za pomocą chromatografii. Nie chodzi tutaj o dokładne badanie i otrzymanie wyników w gramach na litr, tylko o prostą wizualizację: czy dany kwas jest obecny i jeśli tak, to czy jest go dużo czy mało.
Efekt wygląda jak poniżej. Próbki zostały naniesione w punktach zaznaczonych na linii u dołu. Żółte kropki pionowo nad miejscem naniesienia próbek reprezentują poszczególne kwasy: winowy (najniżej), jabłkowy oraz mlekowy (najwyżej).
Na karteczce po prawej stronie są referencyjne próbki poszczególnych kwasów. Na karteczce po lewej są dwa różne cydry („K”, „Y”) oraz świeżo wyciśnięty sok. Jak widać, w soku jest wyłącznie kwas jabłkowy, podczas gdy w cydrach ewidentnie doszło do FJM, bo pojawiło się w nich sporo kwasu mlekowego.
Procedura
Przeprowadzenie chromatografii polega na:
- naniesieniu próbek na specjalny papier
- zanurzeniu dolnego brzegu kartki w specjalnym roztworze
- poczekaniu aż papier naciągnie roztwór (kilka godzin)
- wyjęciu kartki i poczekaniu na ujawnienie się kolorów
Papier
Do przeprowadzenia chromatografii potrzebny jest specjalny papier.
Powszechnie polecany jest papier Whatman 1 Chr, ale są też inne np. Ahlstrom-Munksjö FN3. Trzeba go niestety zamawiać w specjalistycznych firmach i jest dość drogi: kilka złotych za karteczkę, podczas gdy w opakowaniu jest minimalnie 100 sztuk.
Próbowałem używać jako zamiennika różnych ogólnodostępnych papierów, w tym papierów filtracyjnych – niestety z bardzo kiepskimi rezultatami.
Naniesienie próbek
Próbki nanosi się w odległości ~2,5cm od dolnej krawędzi. Chodzi o to, żeby było możliwie nisko, ale żeby roztwór do którego będziemy te próbki wkładali ich nie dotykał. Trzeba wziąć pod uwagę, że próbki przy nakładaniu będą się troszkę rozpływać. Również odstępy pomiędzy próbkami powinny wynosić przynajmniej 2,5cm. Przed nałożeniem próbek warto zaznaczyć sobie miejsca poszczególnych aplikacji i opisać. Oznaczenia najlepiej robić ołówkiem, bo grafit nie wchodzi w reakcje z roztworem do chromatografii.
Nakładane próbki powinny być bardzo małe. Po wsiąknięciu w papier powinny tworzyć plamkę o średnicy nie większej niż 1 cm. Objętość nakładanej próbki odpowiada pojedynczej kropli z cienkiej igły strzykawkowej.
Próbki trzeba nakładać na papier przynajmniej 3-krotnie, żeby zwiększyć stężenie kwasu. Próbki o małej zawartości kwasu, warto nałożyć więcej razy. Przed każdym kolejnym nałożeniem plamka na kartce powinna dobrze wyschnąć, inaczej będzie się coraz bardziej rozpływać. Żeby przyspieszyć ten proces, można posłużyć się suszarką do włosów.
Chociaż nakładanie próbek strzykawką jest jak najbardziej możliwe, to wymaga ono dużego skupienia i precyzji, bo przy odrobinie nieuwagi łatwo nalać za dużo lub prysnąć na kartkę. Zdecydowanie wygodniej aplikuje się próbki specjalną pipetą, którą można ustawić na podawanie określonej objętości – np. 2,5 uL. Do nakładania różnych próbek trzeba używać innego zestawu igła+strzykawka, lub innej końcówki do pipety.
Nakładając próbki, kartkę dobrze jest położyć na ręczniku papierowym oraz nie przesuwać, żeby próbki nie odbiły się od spodu w różnych miejscach.
Tak wyglądają próbki podczas nakładania:
Przygotowanie roztworu
Do przygotowania roztworu do chromatografii potrzeba:
- 200 ml alkoholu butylowego (1-bunatol)
- 200 ml wody destylowanej
- 21 ml kwasu mrówkowego
- 0,3 g zieleni bromokrezolowej
Wszystkie te odczynniki są dostępne np. na Allegro.
Ilość otrzymanego w ten sposób roztworu jest odpowiednia do wykonania chromatografii w 4L słoju, którego akurat używam (o tym w dalszej części). W razie potrzeby trzeba sobie te proporcje przeskalować.
Alkohol butylowy jest tutaj głównym rozpuszczalnikiem, który rozwija chromatogram zwilżając papier ku górze. Kwas mrówkowy obniża pH, a co za tym idzie chroni słabe kwasy organiczne i ułatwia ich przemieszczanie. Zieleń natomiast jest wskaźnikiem, który reaguje na kwas barwiąc się na żółto, podczas gdy normalnie ma kolor zielono-niebieski.
W celu przygotowania roztworu wszystkie składniki należy ze sobą porządnie wymieszać, a następnie zostawić na pewien czas aby fazy się rozdzieliły i wytrąciła się woda. Woda opada na dno – interesujący nas roztwór jest na górze i trzeba go stamtąd delikatnie zlać.
Woda jest konieczna żeby stworzyć odpowiednie środowisko do zajścia reakcji i uwodnienia składników, ale po zajściu reakcji trzeba pozbyć się jej nadwyżki – niestaranne usunięcie wody powoduje powstanie na chromatogramie zacieków.
Tak przygotowany roztwór można długo przechowywać. Ale każdorazowo przed użyciem trzeba sprawdzić czy nie wytrąciła się woda i jeśli tak, to się jej pozbyć.
W Internecie można spotkać się z propozycją przygotowania roztworu chromatograficznego na bazie toluenu i octu – ale z tego co wyczytałem, taki roztwór gorzej sprawdza się w chromatografii kwasów organicznych.
Można też spotkać się z zaleceniami, żeby w celu zwiększenia dokładności nie dodawać barwnika do roztworu, tylko żeby stosować go osobno w charakterze „wywoływacza” – poprzez zanurzenie lub spryskanie nim kartki na koniec. Próbowałem, ale nie widzę znaczącej różnicy.
Składniki użyte do przygotowania roztworu, szczególnie kwas mrówkowy, mają dość intensywny zapach, więc najlepiej się nimi posługiwać w dobrze wentylowanym pomieszczeniu.
Próbki referencyjne
Jako próbek referencyjnych najlepiej użyć ~3% roztworów odpowiednich kwasów, czyli rozpuścić 3g w 100ml.
Rozwijanie chromatogramu
Rozwijanie chromatogramu, bo tak chyba formalnie nazywa się ten etap, polega na umieszczeniu kartki w naczyniu z przygotowanym uprzednio roztworem, tak żeby zanurzony był tylko jej brzeg, na wysokość 0,5-1cm, na następnie poczekaniu aż siły kapilarne podciągną roztwór i zwilżą kartkę. Ja robię to w słoju o pojemności 4L:
W moim przypadku siły kapilarne podciągają roztwór do wysokości maksymalnie 23cm i taki proces trwa około 8-9 godzin. Ale nie trzeba czekać tak długo – można przerwać rozwijanie chromatogramu wcześniej, gdy poziom rozpuszczalnika będzie niżej. Oczywiście im wcześniej zakończy się rozwijanie chromatografu, tym plamki będą na mniejszych wysokościach, a odstępy między nimi będą mniejsze. Tak wygląda chromatogram wyjęty po 4h, w porównaniu z takim w pełni rozwiniętym:
Przy okazji: powyższy chromatogram został „wywołany” dopiero po wyschnięciu, poprzez spryskanie kartki roztworem barwnika. Dodatkowo, wszystkie próbki to ta sama mieszanina kwasu jabłkowego z mlekowym (1:1), a różnica w wielkości plamek bierze się stąd, że próbki były nakładane odpowiednio: 1x, 3x i 6x.
A tak wygląda chromatogram wyjęty po ~1h. Ta kartka jest ustawiona bokiem, wysokość całkowita 10cm. Próbka była tutaj mieszaniną wszystkich trzech kwasów referencyjnych (1:1:1).
Kartki nie powinno się trzymać zanurzonej w roztworze zbyt długo. Lepiej ją wyjąć zanim poziom zwilżenia osiągnie maksymalną wysokość. Przeciągnięty chromatogram, pozostawiony w roztworze o kilka godzin za długo, staje się mniej wyraźny, a kwas mlekowy ma tendencje do „uciekania” na górną krawędź.
Podczas rozwijania chromatogramu, naczynie powinno być szczelnie przykryte. Raz ze względu na zapach, a dwa żeby z roztworu nie odparowywał alkohol.
Suszenie i okazywanie plamek
Po nasączeniu rozpuszczalnikiem, chromatogram trzeba pozostawić do wyschnięcia i poczekać na okazanie się plam.
Początkowo chromatogram jest w całości żółty – jest to spowodowane obecnością kwasu mrówkowego, który zakwasza całe podłoże. Kwas ten jest bardzo nietrwały i z czasem ulega neutralizacji. Podłoże staje się neutralne, za wyjątkiem miejsc w które zawędrowały poszczególnie kwasy z próbek – te pozostają kwaśne. Zmiana barwy kartki na zielono-niebieską oraz okazywanie się plam kwasów trwa zwykle kilka godzin.
Jeśli pomimo wyschnięcia i odczekania kilku godzin obraz na chromatogramie jest wciąż niezbyt wyraźny, można spróbować przyspieszyć neutralizację kwasu mrówkowego za pomocą oparów amoniaku. W tym celu wystarczy otworzyć butelkę z wodą amoniakalną i pomachać nad niż kartką z chromatogramem. Efekt jest natychmiastowy:
Nie powinno się pozostawiać kartki w oparach amoniaku zbyt długo, bo mogą one zneutralizować również pozostałe kwasy.
Chromatogramy nie są bardzo trwałe – z czasem plamy kwasów rozmywają się i blakną. Więc dla celów archiwalnych, najlepiej zrobić sobie zdjęcie.